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伤寒Vi多糖柱层析纯化工艺的优化

择要

目标:优化伤寒Vi 多糖柱层析纯化工艺,以替换传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法。要领:接纳DEAE 离子交换层析柱,离别正在缓冲液(20 mmol/L Tris-ClpH 值为6. 07. 0 8. 0 的条件下纯化1 批伤寒Vi 多糖粗糖,并取传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法停止对照。按《中国药典》三部(2010 版)要求检测纯化样品的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、份子巨细及内毒素含量,并盘算样品的多糖回收率。接纳优化的DEAE 柱层析纯化工艺纯化3 批伤寒Vi 多糖粗糖,考证该工艺的稳定性。效果DEAE 离子交换柱缓冲液(20 mmol /L Tris-ClpH 值为7. 0 8. 0 时,可有用将伤寒Vi 多糖的杂质取纯化产品星散,多糖回收率离别为36. 52% 38. 35%,显着高于传统工艺的多糖回收率(15. 52%),且纯化产品的内毒素含量(10 EU /μg)显着低于传统工艺(200 EU/μg)。以优化工艺(pH 7. 0)纯化3 批伤寒Vi 多糖粗糖得到的6 批精糖的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、份子巨细、内毒素含量及多糖回收率差别较小,标准偏差均小于5%。结论优化了伤寒Vi 多糖柱层析的纯化工艺,该工艺稳定性优越,可替换传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法,应用于伤寒Vi 多糖的纯化。
 
伤寒是由伤寒沙门杆菌引发的一种急性肠道流行症,该病经肠道熏染网状内皮细胞体系、肠道淋巴体系和胆囊而致急性满身性感染。我国自1998 年洪涝灾害后,伤寒发病率逐步降低。据2008 年中国卫生部统计,伤寒或副伤寒的感染率为118/10 万,病死率约为0. 04 / 10 万,该病是中国发病率前十位的流行症之一[1]。WHO 推荐运用伤寒Vi 多糖疫苗防备伤寒的盛行2。研讨注解,大规模的运用伤寒Vi 多糖疫苗,可显着低落伤寒的盛行,减轻社会的经济肩负3-4
伤寒Vi 多糖的有用抗原为细胞壁中的荚膜多糖。传统纯化工艺多接纳苯酚抽提、乙醇分级沉淀等要领,该要领所运用的提取试剂对环境污染严峻,工艺的烦琐致使多糖回收率偏低。本实行对纯化前提温文的DEAE 阴离子交流层析法的pH 值停止了剖析对照,竖立一种步调简朴、纯化结果好、环境污染小的伤寒Vi 多糖柱层析纯化工艺,并对该要领的稳定性停止考证,以替换传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法,应用于伤寒Vi 多糖的纯化。
1 质料及要领
1. 1 样品4 批伤寒Vi 多糖粗糖(批号为STVi20111206STVi 20111207STVi 20120101 STVi20120102)由本公司发酵研究室供应。
1. 2 重要试剂及仪器Tris-Cl 和氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司;AKTA explorer 层析体系、DEAE 层析填料和XK26/20 层析柱均购自GE 公司。
1. 3 DEAE柱层析纯化接纳AKTA exploere 层析体系,DEAE 填料柱体积为45 ml,用20 mmol/L Tris-ClpH 6. 07. 0 8. 0)缓冲液充裕均衡DEAE柱。称与伤寒Vi 多糖粗糖(STVi 20111206300 mg,按5 mg/ml 消融于20 mmol/L Tris-ClpH 6. 07. 0 8. 0)缓冲液中,经0. 45 μm 滤膜过滤后,按每毫升填料5 ~ 10 mg 样品上样于预处理好的DEAE 层析柱,流速为3 ~ 6 ml/min,用缓冲液A20 mmol/L Tris-ClpH 6. 07. 0 8. 0)]淋洗4 ~5 倍柱体积,用缓冲液B20 mmol/L Tris-Cl +0. 5 mol/L NaClpH 6. 07. 0 8. 0)]停止10 ~15倍柱体积的一连梯度洗脱。纯化历程离别用紫外206260280 nm 波长检测多糖、核酸及卵白含量。收集穿透峰,除菌过滤后用打针用火透析48 h,置真空枯燥,用于后续检测。
1. 4 传统工艺纯化参考《中国药典》三部(2010 版)5伤寒Vi 多糖疫苗)的要领纯化伤寒Vi 多糖粗糖(STVi20111206)。
1. 5 纯化样品的检测与适当纯化产品,用打针用火消融,根据《中国药典》三部(2010 版)5对纯化产品的蛋白质含量(应小于10 mg/g)、核酸含量(应小于20 mg/g)、O-乙酰基含量(应不低于2. 0 mmol/g)、份子巨细(多糖份子的KD 值正在0. 25 之前的洗脱液多糖回收率应正在50%以上)及内毒素含量停止检测,并停止览判别实验(Vi 多糖取伤寒Vi 血清发生显着沉淀线)。按下式盘算多糖回收率。
多糖回收率(%= 粗糖的支量(g/粗糖的投量(g)× 100%
1. 6 DEAE柱层析稳定性的检测接纳优化的DEAE柱层析工艺纯化3 批伤寒Vi 多糖粗糖(STVi 2011-1207STVi 20120101 STVi 20120102),并对纯化产品停止相干项目的检测,盘算标准差(SD)和变异系数(CV),考证该工艺的稳定性。
2 效果
2. 1 DEAE 柱层析纯化检测效果可见,上样缓冲液为pH 6. 0 20 mmol/L Tris-Cl 时,目标产物流穿,但核酸和纯卵白已联合正在层析柱上,随穿透峰一同穿出;上样缓冲液为pH 7. 0 20 mmol/LTris-Cl 时,目标产物流穿,核酸和纯卵白联合于层析柱上,并随缓冲液B 梯度的增添逐步被洗脱下来;上样缓冲液为pH 8. 0 20 mmol/L Tris-Cl 时,纯化结果取pH 7. 0条件下类似,见图1
2. 2 纯化样品的审定检测效果注解,DEAE 柱层析纯化缓冲液pH 值为6. 0 时没法有用去除伤寒Vi多糖中的纯卵白及核酸,其纯化产品的蛋白质含量是pH 7. 0 pH 8. 0 条件下的17. 86 15. 37 倍,核酸含量是pH 7. 0 pH 8. 0 条件下的5. 25 6. 06倍,内毒素含量近低于传统工艺,仅为传统工艺的5%。见表1。传统工艺纯化多糖回收率为15%,而DEAE 柱层析工艺(pH 7. 0 pH 8. 0)纯化多糖回收率离别为36. 52%和38. 35%,见表2。因为伤寒Vi 多糖中露O-乙酰基,正在碱性条件下O-乙酰基易脱落,因而,本实行挑选pH 7. 0 为层析纯化的最好前提。
2. 3 DEAE 柱层析的稳定性检测效果注解,以优化工艺纯化3 批伤寒Vi 多糖粗糖得到的6 批精糖的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、份子巨细、内毒素含量及多糖回收率差别较小,标准偏差均小于5%。注解该要领具有优越的稳定性。见表3 和表4
 
 
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3 议论
一般正在离子交换层析中,pH、离子强度等前提是纯化结果的关键因素,本实行接纳DEAE 柱层析纯化多糖是使纯化产品经层析柱后流穿,杂质联合于层析柱上,因而,离子强度对该纯化要领无主要影响。本实行重点是对层析柱的pH 值停止了优化。
实行效果注解,正在缓冲液(20 mmol/L Tris-ClpH 6. 0 条件下未能将目标产品取杂质星散,正在pH 7. 08. 0 条件下多糖流穿,大部分核酸及卵白等杂质联合于层析柱上,并随缓冲液B 梯度的增添而被逐渐洗脱下来,因为伤寒Vi 多糖中露O-乙酰基,正在碱性条件下O-乙酰基易脱落,因而,挑选pH 7. 0 作为伤寒Vi 多糖的最好柱层析纯化前提。
为制止疫苗生产过程中苯酚等有毒化学试剂及下浓度乙醇、甲醇等易燃易爆的有机溶剂对疫苗质量的影响6-7,接纳当代纯化手艺对传统的生产工艺停止革新,削减或弃用有毒化学试剂,以进步疫苗产品质量。Pato 8讨论了流脑C 群荚膜多糖的柱层析纯化工艺,海内也报导层析法对流脑A 群荚膜多糖去纯卵白的有效性9
伤寒Vi 多糖疫苗的有用抗原局部为荚膜多糖,一般提取荚膜多糖的要领是以Gotschlich 法为根蒂根基10,传统伤寒Vi 多糖的提取工艺多接纳苯酚抽提、乙醇分级沉淀等要领5-6,11,但苯酚为有毒化学试剂,为该疫苗的运用带来肯定的安全隐患,因而,本实行经由过程接纳DEAE 离子交换层析,肯定了缓冲液20 mmol/LTris-Cl pH 7. 0 DEAE 层析柱工艺的最好前提,中性pH 值确保了多糖构造的稳定性,进步了纯化产品的质量指标,且显着低落了纯化产品的内毒素含量。
本实行接纳优化的DEAE 柱层析工艺对3 批粗糖停止了纯化,实行效果显现,所得到的6 批精糖质量均相符划定,蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、份子巨细、内毒素含量及多糖回收率差别较小,标准偏差均小于5%,注解该工艺具有优越的稳定性,易于工艺放大,进步了疫苗的安全性及产物的质量标准,可替换传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法,应用于伤寒Vi 多糖的纯化。
 
 
参考文献
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